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高效毛细管电泳仪在核酸分析中的应用

2021年08月12日 茂名机械设备网

高效毛细管电泳仪在核酸分析中的应用

高效毛细管电泳仪简称毛细管电泳仪(CE),是以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,利用荷电粒子之间的淌度差异和分配系数差异进行分离,是分析科学继高效液相色谱仪之后的又一重大进展,使分析科学从微升级进入到了纳升级水平,不仅使单细胞乃至单分子分析成为可能,也使蛋白质和核酸等生物大分子分析有了新的转机。一、在DNA测序中的应用:人类基因组计划对人类基因组DNA全序列测定随着电泳从平板凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、线性高分子溶液毛细管电泳、毛细管阵列电泳,到全基因组鸟枪测序技术的发展,已于2001年宣布提前完成,被公认为是分析化学家拯救了人类基因组计划。对其它生物的DNA测序仍在继续,方向主要是提高测序速度、有效度和大分子片段的认读长度。人类基因组计划提前完成的关键是DNA测序方法的改进,而CE就是一种比较适合快速、灵敏、有效、廉价和自动化等要求的方法之一。1、毛细管凝胶电泳(CGE):CGE是将平板凝胶电泳的凝胶移到毛细管中作支持介质的电泳,可按照分子大小进行分离。常用支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。1990年,首次用CGE进行DNA序列测定的尝试,并初步获得成功,随后凝胶的制备和新分离模式迅速发展。CGE与LIFD相结合,成为DNA快速序列分析的优选方案之一,并对人类基因组计划的完成发挥了重要作用。2、线性高分子溶液毛细管电泳:虽然CGE是CE中分离度极高的一种模式,但CGE的凝胶柱制备和应用仍然存在问题,如凝胶形成、电泳中气泡的产生和使用过程中焦耳热对支持介质的降解使毛细管寿命缩短等。而在低粘度的非交联线性高分子溶液DNA测序中,高分子溶液可更换,使寿命延长。1993年,首次使用线性聚丙烯酰胺进行DNA测序。随着技术的不断改进,线性高分子溶液毛细管电泳采用程序升温已用于DNA限制性片段快速分离,采用脉冲电场毛细管进行DNA测序,分离的DNA片段可达1000bp。3、毛细管阵列电泳(CAE):一般的CE很难做到传统聚丙烯酰胺凝胶电泳所具备的多通道同时分析,利用共焦激光荧光扫描检测系统解决了由多根毛细管组成的毛细管阵列同时检测的问题,这一技术被称为毛细管阵列电泳(CAE)。CAE无需凝胶,样品用量少,提高了效率,降低了测序成本,并实现了自动化,加快了速度,但仍有必要进行更高通量的检测和进一步降低费用。CAE曾成为人类基因组计划第二个五年计划(1998~2003年)对DNA测序的三条发展途径之一。检测器一般分为扫描光学检测器和电荷耦合元件(CCD)阵列检测器两类。放射性阵列毛细管微板与扫描器联用,可实现高通量的DNA检测,96个样品采用压力式毛细管阵列平行进样,可使96个PBR322限制性内切酶片段在120s内得到高效分离。若同时使用40块微板,每块微板上有384个分离通道,则一次进样量可达15000个,从而达到高通量DNA分析和测序的目的。此外,CE不仅可对DNA的合成片段进行纯度检验,对PCR扩增的DNA模板进行纯化和从反应体系中去除,还可进行文库建立或复制,启动子作用方式检测自然和人工合成RNA的结构。二、在基因突变分析中的应用:基因突变分析是遗传性疾病基因诊断和致病基因分离鉴定的基础,突变是一个或多个脱氧核糖核苷酸的构成、复制或表形功能的异常变化,即遗传物质结构改变引起遗传信息改变。随着对疾病病因和发病机制研究的不断深入,人类对疾病的认识逐渐深入到基因诊断的水平,传统技术多用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离野生型DNA分子和突变DNA分子,但费时、费力,不适合自动化,而CE可快速获得基因突变模式的信息。基因突变分析主要分为未知基因突变分析和已知基因突变分析,在实际应用中,许多检测未知基因突变的方法也可用于检测已知基因突变。CE用于基因突变分析的方法有单链构象多态性分析、限制片段长度多态性分析、异双聚体DNA多态性分析、双脱氧指纹谱图分析和毛细管电泳分子信标技术等。1、毛细管电泳-单链构象多态性分析:单链构象多态性分析检测基因突变的原理是将DNA变性形成单链,由于核苷酸不同而形成不同的二级空间构象。在毛细管电泳-单链构象多态性分析中,迁移速度主要取决于其二级空间构象,不同单链的DNA的迁移速度不同。如果基因的某些位点发生碱基突变,会引起单链DNA二级空间构象的改变,可在一定介质中用CE检测突变的基因。毛细管电泳-单链构象多态性分析与平板凝胶电泳相比,在分离速度和分辨率等方面具有明显的优势,是一种快速、简便检测基因突变的技术,适用于未知突变基因的筛选。2、聚合酶链反应-限制片段长度多态性分析:基因突变常引起某一区域限制性内切酶的酶切位点消失或因突变产生新的酶切位点。用适当的酶进行酶切时,突变基因产生与正常基因长度不同的片段,用CE分离时会产生代表不同片段长度的峰。适用于某个已知固定位点基因突变的检测。3、异双聚体DNA多态性分析:异双聚体DNA多态性分析是利用构象多态性引起电泳迁移速度改变,检测DNA非限制性位点突变,可快速、高效地筛选突变基因,整个分析时间不超过30min。4、双脱氧指纹谱图分析:双脱氧指纹谱图分析是将双脱氧核苷酸测序和单链构象多态性分析相结合的分析方法。5、毛细管电泳分子信标技术:毛细管电泳分子信标技术可对核酸进行实时检测,也可用于活体内核酸的动态检测。

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